Structural Basis of the Human Melanogenic Enzymes

Abstract

Melanogenesis, the complex process of melanin biosynthesis, is highly regulated by members of the tyrosinase family. In human, the three main enzymes that play important role in the human melanogenesis pathway are tyrosine (TYR), tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) and tyrosinase-related protein 2 (TYRP2). These melanogenic enzymes are membrane-bound metalloenzymes with divalent metal ions at their active sites and are heavily glycosylated.
Previously, our group developed large-scale expression and purification protocols for the intramelanosomal constructs of human TYR and TYRP1, suitable for structural studies. We also determined the 3D structure of human TYRP1, which was the first structure of a human melanogenic enzyme. However, structural determination of human TYR has remained challenging due to poorly diffracting protein crystals.
Building on previous work, this thesis has employed both biochemical and biophysical methods to push the boundaries of our current understanding on the human melanogenesis pathway through structural study of the key enzymes. Using a eukaryotic cell expression system, we successfully expressed and purified large quantities of soluble melanogenic enzymes for biochemical assays and crystallography.
For TYRP1, new crystallisation conditions yielded crystals with improved diffraction resolution and a novel crystal packing. Further X-ray experiments confirmed the previous identification of TYRP1 as a zinc-protein. Collaborative drug discovery efforts using TYRP1 crystals identified several promising compounds to explore the active site biding and metabolism of tyrosinase-derived substrates, aiming to develop safer and more efficient tyrosinase inhibitors. For TYR, controlled crystal dehydration data collection methods improved diffraction resolution, yet structural determination remains challenging. For TYRP2, significant progress has been made with the large-scale purification of intramelanosomal constructs, while crystallisation efforts are ongoing. Additionally, in vitro enzymatic activity assays and enzyme heterocomplex formation experiments highlight the importance of metal specificity for the catalytic activity and assembly of these enzymes. These findings challenge longstanding hypotheses about their enzymatic function and underscore the intricate regulation of melanogenesis.
This thesis advances our understanding of the human melanogenic pathway through the large-scale production of TYRP2 suitable for structural and biochemical studies, the improvement of TYR crystal diffraction approaches, the identification of potential tyrosinase modulators, and the analysis of metal specificity in the catalytic activity of melanogenic enzymes. These insights provide valuable information for elucidating the melanogenesis pathway and could offer potential therapeutic targets.

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Résumé

La mélanogenèse, le processus complexe de biosynthèse de la mélanine, est fortement régulée par les membres de la famille de la tyrosinase. Chez l'homme, les trois principales enzymes qui jouent un rôle crucial dans la voie de la mélanogenèse sont la tyrosinase (TYR), la protéine 1 liée à la tyrosinase (TYRP1) et la protéine 2 liée à la tyrosinase (TYRP2). Ces enzymes mélanogéniques sont des métalloprotéines membranaires avec des ions métalliques divalents à leurs sites actifs et sont fortement glycosylées.
Auparavant, notre groupe a développé des protocoles d'expression et de purification à grande échelle pour les constructions intramélanosomales de TYR et TYRP1, adaptés aux études structurelles. Nous avons également déterminé la structure 3D de la TYRP1 humaine, qui a été la première structure d'une enzyme mélanogénique humaine. Cependant, la détermination structurelle de la TYR humaine reste difficile en raison des cristaux de protéines à faible pouvoir de diffraction.
S'appuyant sur ces travaux antérieurs, cette thèse utilise des méthodes biochimiques et biophysiques pour repousser les limites de notre compréhension actuelle de la voie de la mélanogenèse humaine à travers l'étude structurelle des enzymes clés. En utilisant un système d'expression de cellules eucaryotes, nous avons réussi à exprimer et purifier de grandes quantités d'enzymes mélanogéniques solubles pour des essais biochimiques et de cristallographie. Pour la TYRP1, de nouvelles conditions de cristallisation ont permis d'obtenir des cristaux avec une meilleure résolution de diffraction et un empilement cristallin inédit. Des expériences de diffraction des rayons X ont confirmé l'identification précédente de TYRP1 en tant que protéine-zinc. Des efforts de découverte de médicaments utilisant les cristaux de TYRP1 ont permis d'identifier plusieurs composés prometteurs pour explorer la liaison au site actif et le métabolisme des substrats dérivés de la tyrosinase, dans le but de développer des inhibiteurs de tyrosinase plus sûrs et plus efficaces. Pour la TYR, les méthodes de collecte de données par déshydratation contrôlée des cristaux ont amélioré la résolution de diffraction, mais la détermination structurelle reste difficile. Pour la TYRP2, des progrès significatifs ont été réalisés avec la purification à grande échelle des constructions intramélanosomales, tandis que les efforts de cristallisation sont en cours. De plus, les essais d'activité enzymatique in vitro et les expériences de formation de complexes enzymatiques soulignent l'importance de la spécificité métallique pour l'activité catalytique et l'assemblage de ces enzymes. Ces découvertes remettent en question les hypothèses de longue date sur leur fonction enzymatique et soulignent la régulation complexe de la mélanogenèse.
Cette thèse fait progresser notre compréhension de la voie mélanogénique humaine grâce à la production à grande échelle de TYRP2 adaptée aux études structurelles et biochimiques, à l'amélioration des méthodes de diffraction des cristaux de TYR, à l'identification de modulateurs potentiels de la tyrosinase et à l'analyse de la spécificité métallique dans l'activité catalytique des enzymes mélanogéniques. Ces informations fournissent des éléments précieux pour élucider la voie de la mélanogenèse et pourraient offrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.